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低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）是近年发展起来 的新一代肝素类抗血栓药物，其抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用低于肝 素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小 等优点，目前已广泛应用于临床。根据LMWH的来源、生产工艺、末端结构 的不同，LMWH分为许多不同的种类，如达、依诺肝素、纳、 帕、汀等。达（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一 种，由亚硝酸降解肝素得到，重均分子量5600-6400，峰位分子量6000，硫 酸化程度为2.0-2.5/双糖单位[1]。

达的生产过程中使用了亚硝酸，而亚硝酸根是一种毒性物质，在 人体特定的环境条件下，可以合成一种很强的化学致癌物——N-亚硝基化合 物，能够诱发几乎所有内脏器官的肿瘤。因此，检测达中残留的亚硝 酸根含量，对保证患者用药安全具有重要意义。目前欧洲药典使用离子色谱安培检测法测定达中亚硝酸根含量[2]，国内低分子肝素标准中使用化学 方法对亚硝酸根进行限度检查，无含量测定[3]。欧洲药典的方法未对样品进行 前处理，达保留在色谱柱上，缩短柱寿命，且重现性较差。本文建立 了离子色谱法分离、电导检测器检测达中的亚硝酸根含量的方法，灵 敏度高，线性、回收率、重现性好，可以延长色谱柱寿命。

测试条件
仪器：戴安ICS 3000离子色谱系统（EG淋洗液发生装置）； 分析柱：IonPac AS19，250×4 mm； 保护柱：IonPac AG19，50×4 mm； 柱温：30 ℃； 淋洗液：氢氧化钾（KOH） 梯度淋洗；5-40 mmol/L KOH，0-35 min； 40-5 mmol/L，35-35.1min； 流速：1.00 mL/min； 定量环：100 µL 抑制器：AMMS 4 mm，再生液为25mmol • L-1硫酸
检测方式：抑制型电导

样品前处理
精密称取达0.4 g，加水溶解并稀释至10 mL。 精密量取1 mL至离心管中，加无水乙醇9 mL，摇匀， 10000 r • min-1离心20 min。取上清液，过0.22 µm滤膜， 续滤液进样。

结果和讨论
样品前处理条件的选择
由于达是多羟基的多糖类物质，碱性条件下离 子化，在离子交换柱上有很强的保留，即使使用强的洗脱 溶液如1 mol • L-1氯化钠也很难将其洗脱。达侵占色 谱柱中的位点，可造成色谱柱容量下降，离子保留时间缩 短。去除待测液中的达后进样，可解决这一问题。
去除达的方法主要有乙醇沉淀、阳离子表面活 性剂沉淀、超滤、透析等。阳离子表面活性剂的引入，会 降低色谱柱的柱效；超滤膜可能含有亚硝酸根残留，影响 测定结果；透析需要的时间较长。与以上三种方法相比， 醇沉操作简单、快捷，重现性好，且不易引入杂质，因此 本方法选用醇沉法对样品进行前处理。

色谱柱的选择
样品溶液含有的阴离子，除达正常含有的硫 酸根、残留的亚硝酸根外，还含有氯离子、磷酸根离子 及其他未知阴离子。分别使用IonPac AS11-HC，IonPac AS15，IonPac AS19，IonPac AS23等色谱柱进行分离。 在氯离子和亚硝酸根之间出现未知色谱峰，保留时间与亚 硝酸根接近。降低淋洗液浓度，可增加未知峰与亚硝酸根 的分离度，但同时也造成分析时间延长。比较以上不同色 谱柱的测定结果，在保证未知峰与亚硝酸根分离度的前提 下，IonPac AS19色谱柱的分析时间短，亚硝酸根出峰 时间可控制在10 min以内。IonPac AS19色谱柱良好的分 离效果与其高容量有关。

抑制模式的选择
使用电导检测器时，淋洗液有很高的检测信号。抑 制器可降低淋洗液的背景电导，增加被测离子的电导 值，改善信噪比。常用的抑制模式有化学抑制、电抑制 等。测定阴离子时，化学抑制使用酸作为再生液；电抑 制使用外接水或电导池后流出的废液作为再生液。本方 法的待测溶液中含有高浓度的乙醇，在电抑制模式下， 乙醇有响应且会干扰亚硝酸根的测定，而化学抑制模式 下乙醇无响应值。因此，本法采用25 mmol • L-1硫酸作为 再生液，选用膜抑制器化学抑制。

重现性、线性和灵敏度
取样品溶液分别进样6次，保留时间RSD为0.1%，峰 面积RSD为0.5%. 线性范围 取25～1000 µg • L-1亚硝酸根标准溶液进 样，以峰面积A对浓度C进行回归计算，回归方程为： A=0.000787C+0.001007, r=0.9997 取20μg • L-1的亚硝酸根标准溶液进样，测定其峰高 微0.060 µS，按照3倍信噪比计算其检测限为1 µg • L-1，按 照10倍信噪比计算其定量限为3.3 µg • L-1。

实际样品分析及加标回收
精密称取样品适量，精密量取标准溶液适量加入， 分别制成加标浓度为25，50，100，200 µg • L-1的溶液， 回收率分别为98.5%～107.9%（n=3），见表1。

结论
综上所述，本文建立的亚硝酸根的测定方法，不仅 操作简单，灵敏度高，更具有重现性高，更好的保护色 谱柱等优点。本方法不仅可用于低分子肝素的质量控 制，其前处理方法和检测方法也适用于其他多糖类药物 中的阴离子测定。